小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒說明書 【產(chǎn)品名稱】 商品名稱：小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒 【包裝規(guī)格】50 次/盒 【產(chǎn)品及特點】 本公司開發(fā)小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒上高質量，它具有下列 特點： 1.即開即用更加廣闊，用戶只需要提供 DNA 模板有很大提升空間。 2.引物根據(jù)小鼠細(xì)小病毒專一區(qū)設(shè)計新的動力，特異性高機製性梗阻。 3.熒光定量 PCR 檢測組建，比常規(guī) PCR 更加靈敏進一步。 4.一管式閉管操作更多的合作機會，降低了交叉污染延伸。 5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。 6.本產(chǎn)品只適用于科研服務好，不能用于臨床診斷新趨勢。 【規(guī)格及成分】 成分 編號 塑料盒包裝 2×qPCR MagicMix 90408 500 μL （棕色管） 熒光 PCR 專用模板稀釋液 180701 1 mL （黃蓋） 小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 引物混 合液 4yw-8195 100 μL （白蓋） 小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 陽性對 照(1×10E8 拷貝/μL) 60908-81950 pc 50 μL （黃蓋） 使用手冊 LZ4W-8195 1 份 【運輸及保存】 低溫運輸、 -20℃保存共謀發展， 有效期一年學習。 【自備試劑】 DNA 模板、 超純水聽得懂、 10×ROX （根據(jù)機(jī)型決定應用優勢，具體見使用方法） 。 【使用方法】 一、 稀釋 PCR 陽性對照 （以 10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀 釋度為例） 1.注意： 由于陽性對照濃度非常高高效節能， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的 區(qū)域進(jìn)行影響力範圍，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分） 。 2.標(biāo)記 6 個離心管新創新即將到來，分別為 7邁出了重要的一步， 6， 5設施， 4需求， 3， 2組合運用。 3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯 槍頭更讓我明白了，下同） 。 4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照積極，充分震蕩 1 分鐘充分，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用廣泛應用。 5.換槍頭關註度，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘哪些領域，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照敢於挑戰。放 冰上待用。 6.換槍頭建立和完善，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中提供了遵循，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照大型。 放冰上 待用服務效率。 7.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。 放冰上待用重要意義。 二統籌發展、 樣品 DNA 的制備 8.如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取體系，多出的一個是 PC（樣品制 備陽性對照）生產製造，一個是 NC （樣品制備陰性對照）。 可以用 10μL PCR 陽 性對照的 10000 倍稀釋的 （稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL攜手共進， 10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝共同，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中， 充分混勻經過，此為 100 倍稀釋液簡單化。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自 備 TE 溶液中力度，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液） 再加上一定量的水作 為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣系統性，樣品體積多少取決于所 用試劑盒的要求）勇探新路。可以用水作為制備的陰性對照便利性。制備所得成為樣品 DNA。 9.用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA行動力，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提 取試劑盒兼容提供有力支撐。 三、 設(shè)置 qPCR 反應(yīng) （20 μL 體系保供，在樣品制備室進(jìn)行） 10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)逐步顯現，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管， 其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品引領， 1 個用于 PCR 陰性對照自動化裝置， 6 個 用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析應用前景，并且只做 1 次重復(fù)有很大提升空間，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品首次， 1 個用于 PCR 陰 性對照（用水做模板）可能性更大， 1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照 稀釋液， 濃度為 10E4 拷貝/μL） 搖籃。下面只描述定量分析的步驟技術，定性 分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個， 其余不變推動。 11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)相對較高。樣品管和陰性 對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋 子儲存好后最后加） ： 成分 樣品管 N+2 個 PCR 陰性 對照管 PCR 陽性 對照管 （2-7 管） 2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL 小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 引物混 合液 2 μL 2 μL 各 2 μL 自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL N+2 待測樣品 cDNA 模板 6 μL - - 自備超純水 - 6 - 第 7 步所得 PCR 陽性對照 稀釋 液（2-7 號） - - 各 6μL （2 號樣到 2 號管信息，3 號樣到 3 號管 …） 注:僅 ABI7500相關、 7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照， 其他熒 光 PCR 儀 器（如 iCycler IQ豐富內涵、MJ Option綠色化、MJ Chromo4、MX3000發展、MX4000保持穩定、 RotorGene3000、 RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX面向， 則用水替代支撐作用。 12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR （具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀 器不同而自行優(yōu)化）。 過程 溫度 時間 預(yù)變性 95℃ 5 min PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)） 95℃ 15 sec 60℃ 1 min最為突出，（采集 SYBR 通道的熒光信號） 按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析 四落實落細、 數(shù)據(jù)處理 13. 如果把本試劑盒用于定量檢測， 則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸高效化， 以 Ct 值為縱軸製高點項目， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出 樣品 cDNA 濃度的 log 值支撐能力，再推算出其濃度資源優勢。 14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性特征更加明顯，則陰性對照 Ct 必須 大于或等于 35估算。 陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線的可能性， Ct 值應(yīng) 該小于或等于 30不要畏懼。對待測樣品， 如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性問題， 如 果小于或等于 30 則為 陽性逐漸顯現。如果在 30-35 之間，可結(jié)合熔解曲線判斷系統穩定性，若 樣品的熔解溫度與陽性對照相同更默契了，該樣本判斷為陽性，否則為陰性培訓。 【關(guān)聯(lián)產(chǎn)品】 小鼠細(xì)小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒
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